馬耳他騎士團與馬耳他共和國在今天是兩個沒有關系的政治實體。然而從名字上我們就能知道，二者在曆史上有關系。馬耳他騎士團的全名是“耶路撒冷、羅得島及馬耳他聖約翰主權軍事醫院騎士團”，簡稱“醫院騎士團”或“馬耳他騎士團”。這麽長的名字本身就是騎士團曆史的濃縮。
馬耳他騎士團的前身是著名的醫院騎士團，它成立于 1099 年第一次十字軍東征之後。當時法國貴族在耶路撒冷的施洗者聖約翰教堂附近的醫院裏成立，主要目的是照料傷患和朝聖者，並保護醫院設施，故而這個騎士團被稱爲“耶路撒冷聖約翰醫院騎士團”。
1120 年，法國人雷蒙·杜·皮伊繼承首領位置，在他的帶領下醫院騎士團逐漸從保護朝聖者的醫生、慈善修士轉變爲騎士和職業軍人。同時，作爲修會僧侶，醫院騎士團遠比普通十字軍士兵更安貧樂道、紀律嚴明、吃苦耐勞，戰鬥力更強。
很快騎士團就成爲耶路撒冷王國的重要軍事力量，甚至能夠影響王國的政局。這一時期醫院騎士團與聖殿騎士團、條頓騎士團並稱三大騎士團，在耶路撒冷王國擁有 7 座大要塞，140 多座其它建築。
隨後騎士團一直堅持到 1291 年才放棄巴勒斯坦並前往塞普勒斯。他們獲得了塞普勒斯國王賜予的科洛西城堡及附近的甘蔗種植園和糖廠。
1309 年騎士團從拜占庭帝國手中奪取了羅德島及周圍島嶼。此後騎士團的名稱又加入羅德島。在這裏，騎士團用海軍阻止了穆斯林向東地中海地區的擴張。當 1453 年君士坦丁堡落入土耳其人的手裏時，羅得島是整個東地中海地區唯一的基督教力量。
1798 年 6 月 11 日，出任法國埃及方面軍司令的拿破侖在進軍埃及的途中取道馬耳他。在強勢的攻擊下醫院騎士團投降，拿破侖占領馬耳他島。島上的修道院和教堂被法軍洗劫，騎士團成員便四散開來，多數去往了俄國。俄國沙皇保羅一世承諾給予抵達俄國的騎士團成員庇護，騎士團則選舉保羅一世爲新的騎士團大團長。
離開了馬耳他島之後，騎士團就此失去了領土，但仍作爲一個組織存在，1802 年，騎士團對馬耳他島的主權通過《亞眠條約》(Treaty of Amiens)得到英法等國承認，但從未被允許回到島上。1834 年，醫院騎士團在羅馬重建總部，終于再次穩定下來。這時騎士團的軍事使命已經完結，此後主要從事慈善事業。
自此，“馬耳他”只留在了騎士團的名稱中，而騎士團與馬耳他島已經沒有實際關系。